Tip:
Highlight text to annotate it
X
Witamy w Novus serii Wizualnej Protocol.
W tym filmie dowiemy się, jak wykonać wszystkie etapy Western Blot przy użyciu
Najpopularniejsze metody w tym teście.
Zanim będzie można rozpocząć przygotowania blot najpierw musimy przygotować nasz lizatu próbki.
W tym przykładzie przygotowania białka z lizatu komórek hodowlanych.
Tutaj
myjemy komórki dwukrotnie lodowatym PBS
i dość bufor do lizy na pokrycie komórek.
Wybór buforu do lizy dużej mierze zależy od Twojego
Wybór białka.
Mamy zeskrobać komórek i przenieść roztwór komórek w probówce
umieszczono w lodzie.
W celu rozpuszczenia białka związane z błoną, żądamy silniejsze
detergenty wydobycia w stosunku do izolowanych białek cytoplazmatycznych.
W tym przykładzie
używamy standardowego buforu Ripa,
która jest wspólna dla uzyskania maksymalnej bufora wydajność białka. Podczas rozpakowywania
białka z wszystkich lokalizacjach komórkowych,
Bardzo ważne jest to, aby jak inhibitorów proteazy w buforze lizy, który będzie
zapobiegania degradacji próbki. Zawsze należy używać świeżo przygotowane proteazę
Inhibitory przechowywać próbki na lodzie i działać szybko.
We wszy komórek przez pipetowanie w górę iw dół
następnie inkubowano na lodzie w ciągu pół godziny.
Następnie komórki wiruje się w granulki.
Wyrzucić osad i zebrać supernatant. To jest Twój lizat.
Określenie stężenia całkowitego białka swojego lizatu przez
testowanie niewielką część swojej lizatu
dostępny w handlu z ilościowego oznaczenia białek
takich jak BCA.
To pomoże w załadunku równe ilości białka do swojego żelu.
Western blot są tradycyjnie wstępnie kształtowane pod zmniejszonym i skażone
warunki. Te warunki pozwolą białka być oddzielone ich
Masa cząsteczkowa
niż ojczysty konformacyjne kształt lub opłat.
Redukcji i denaturacji próbki
każdego rozcieńczenia w buforze do ładowania takiego jak tradycyjny bufora Laemmli.
Bufor ten zawiera beta-merkaptoetanol, DTT, zmniejszenie dwusiarczek
między cystein,
SDS pomóc denaturacji netto negatywny białko,
glicerol aby próbki popadają w każdej studzienki
błękit bromofenolowy wizualizować lizatu oraz kultowego bufor.
Votex każda próbka i inkubować w temp. 95 stopni Celsjusza, na pięć minut do
całkowicie denaturacji białka. Teraz jesteśmy gotowi, aby załadować swoje próbki do
w żelu SDS-PAGE.
W tym kolejnym kroku będziemy oddzielać poszczególne białka w próbce
lizatu
na podstawie ich masy cząsteczkowej
stosując elektrodę dodatnią przyciągnąć ujemnie naładowaną białko.
Aby to zrobić
ładujemy nasze wcześniej przygotowane próbki białka do dostępnych w handlu
żelu poliakrylamidowym.
Żele są dostępne w stałych procentowymi lub gradientów akryloamidu.
Wyższa akryloamid mniejsza część żelu
procentowy.
Dlatego wyższe żele procentowych są lepsze dla małych białek masy ciała, niski odsetek
żele są lepsze dla dużych białek gradientowych żeli i masy można stosować
Białka wszystkich rozmiarach
ze względu na ich różną w zakresie wielkości porów.
Przygotuj swój żel, wkładając go do aparatu do elektroforezy i
napełniania buforze, który jest odpowiedni dla chemii żelu.
Przepłukać studzienek w żelu z buforze i dodać bufor
Komory.
Załadować swoje próbki do studzienek.
Jeśli nie jesteś pewien kwoty do załadowania,
30/10 mikrogramów białka całkowitego jest punktem wyjścia sugeruje
oraz całą ilość próbki ładowane.
Potrzebny będzie również do zarezerwowania co najmniej jeden dobrze prestained masie cząsteczkowej
drabina.
Drabina będzie można monitorować w czasie separacji białek
elektroforezy, a następnie weryfikację masy białka w próbce w czasie
późniejszej analizy.
Zamknij moduł elektroforezy i podłączyć go do zasilania. Większość jednostek
zwykle uruchamiane 45-60 minut w 200 woltów
lub do buforu osiągnięciu końca żelu.
W tym czasie, ujemnie naładowane białka w każdej próbce migrują w kierunku
dodatnio naładowane elektrody torują sobie drogę przez poliakryloamidu
żel matrycy.
W następnym etapie tego, przekierujemy nasze oddzielnych białek z żelu
i w stałym lub błony blot.
Jest to oparte na samej zasadzie, co w poprzednim etapie
, w którym pole elektryczne jest pobierana do usuwania białek negatywnych
w kierunku elektrody dodatniej.
Przeniesienie może nastąpić w warunkach mokrych lub półwytrawne.
Tutaj pokażemy tradycyjną mokrą metodę przesyłania. Zacznij od usunięcia
Żel z jego kasety
cięcia górną część zawierającą studni.
Notch lewy górny róg do wskazanej orientacji żelu.
Spławik żel w buforze transferu podczas przygotowywania kanapek transferu.
, Aby zrobić kanapkę transferu
będziesz potrzebował kasetę,
gąbka, bibuła
Żel
i twój wybór albo PVDF lub błoną nitrocellulous.
PVDF należy uaktywnić przez zanurzenie membrany w etanolu
dwie minuty. Ale poza tym PVDF lub wybór nitrocellulous
Membrana jest osobistych preferencji.
Notch lewy górny róg, aby wskazać orientację blot
i inkubowano w buforze do transferu błon przez 10 minut.
Utworzyć stos przez umieszczenie następujące składniki
z czarnej katody ujemnej do dodatniej anody czerwonym:
gąbka,
filtr papierowy,
membrany,
(Należy uważać, aby nie dotknąć żelu lub membranę gołymi rękami i użyć
czyste pęsety lub łopatki zamiast.
Dotknięcie membrany w każdej fazie może zanieczyścić blot i prowadzić do
nadmierny sygnał tła. ),
filtr papierowy
i gąbki.
Użyj czystej rolkę z każdej warstwy delikatnie rozciągnąć wszystkie pęcherzyki, które mogą być
przedstawienie
ponieważ pęcherzyki hamuje skuteczne przekazanie białka.
Zablokować kasetę i umieść go w urządzeniu zawierającym zimno
przenieść bufor
zapewnienie, że kaseta jest prawidłowo ustawione z ujemnego na dodatni.
Aby zapobiec gromadzeniu się ciepła, to jest korzystne, aby przenieść w zimnej
opakowanie w urządzeniu
Urządzenie lub chłodni z paska przędzarki umieszczony na dnie komory.
Zamknąć komorę i podłączyć do zasilania.
Wykonania przelewu zgodnie z instrukcjami producenta, który jest
normalnie 100 wolt dla trzydziestu do stu dwudziestu minut.
Po electrotransfer naszych białek na membranę, będziemy
teraz blokować blot,
zastosowanie specyficznego przeciwciała podstawowego białka dla naszego zainteresowania i średnie
przeciwciała, które rozpoznaje przeciwciał pierwotnych.
Jest usunięcie błony z kasety i płukanie wodą trzy razy.
W opcjonalnym kroku, można sprawdzić, białka przenoszono powodzeniem
przez barwienie błony z Ponceau czerwono.
Inkubować membranę w Ponceau pięć minut i zmyć wodą, aż
zespoły są jasne.
Po weryfikacji
blot może być de-barwione nadal zmyć wodą
Sznurek lub TBS
dopóki barwnik całkowicie usunięte.
Musimy zablokować wszystkie obszary blot, które nie zawiera białka.
Pozwoli to uniknąć niespecyficznego wiązania przeciwciał i zmniejszenia ogólnego
tło sygnał.
Wspólne bufory blokujące zawierające 5% odtłuszczone mleko w proszku w teście
w roztworze TBS sznurka.
Jednak nie używać mleka podczas wykrywania specyficznych przeciwciał z fosfo
gdyż może to spowodować wysokie tło z jego endogennego fosfoproteiny, cez.
Inkubować membranę roztworem blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej
temperatura
w lekkim mieszaniu.
Zlać roztwór blokujący i przemyć TBS sznurka na pięć minut.
Teraz jesteśmy gotowi, aby dodać naszą przeciwciała. Rozcieńczyć przeciwciał pierwotnych, w
buforze blokującym w stężeniu zalecanym na arkuszu danych.
Inkubować przez noc w temperaturze 4 ° C z łagodnym wytrząsaniem.
Zalecane jest opcjonalny etap również używać przeciwciało kontrolne pozytywne
które umożliwia sprawdzenie równe ilości białka całkowitego załadowano do
każdego dołka i doradcy w rozwiązywaniu usuwając
niepewności o procedurze Western Blot.
Następnego dnia,
zlać się pierwsze przeciwciało i przemyć membranę dużych ilościach
TBS szpagatów i energiczne mieszanie
pięć razy w ciągu pięciu minut każda.
Te surowe przemywania są bardzo ważne dla usuwania niespecyficzne
sygnałów tła.
Po przemyciu, rozcieńczenie drugiego przeciwciała w roztworze blokującym i inkubować
Membrana na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, w stężeniu
zalecane na arkuszu danych.
W tym przykładzie jest również wtórne HRP sprzężone na później
wykrywania.
Zlać membrany i umyć wtórne dużą ilością sznurka z TBS
pięciokrotnie energicznego mieszania przez pięć minut każdy.
Jesteś teraz gotowy do etapu detekcji.
W tej ostatniej fazie, pokażemy rozwój sygnału za pomocą najczęściej,
najbardziej wrażliwe i najtańszym metoda wykrywania electrochemiluminescence
(Lub ECL) reakcja.
Metoda ta wykorzystuje enzym HRP,
które skoniugowano z wtórnego do katalizowania reakcji i wytwarzają ECL
światło.
Światło to zebrane na promieniowanie Roentgena i rozwijane
w postaci cyfrowej przy pomocy specjalistycznego aparatu wystarczająco czułe
do tego zastosowania.
Zaczynamy przez zmieszanie równych częściach ECL odczynników w jeden-na-jeden wskaźnik
zgodnie z instrukcjami producenta.
My inkubować membrany przez 3-5 minut, bez mieszania.
Po inkubacji, zlać mieszaninę ECL i użyć laboratorium wytrzeć wytrzeć nadmiar
Roztwór z rogu błony.
Umieścić membranę w jasny folią plastikową, takie jak blachy z zabezpieczeniem w celu zapobiegania
suszenia. Nie pozwalaj membrana całkowicie wyschnąć.
Teraz możemy użyć wałka do wypchnąć pęcherzyki i nadmiar roztworu.
Niezwłocznie opracować membranę.
Zarówno film i systemy kamer pozwala ręcznie ustawić czas ekspozycji
w celu zapewnienia obraz idealny Western biot.
Względne gęstości pasma można teraz ilościowo dostępny
oprogramowanie.
. Właściwa masa cząsteczkowa może być zweryfikowane przez porównywanie rozmiarów zespołu do
molekularna drabina waga.