Tip:
Highlight text to annotate it
X
Z komórkami Plated dnia poprzedniego i nocleg hodowli, jesteśmy gotowi
rozpocząć z procedurą ICC.
W tym pierwszym dniu ICC, będziemy ustalać,
przepuszczalności,
blot i dodać pierwszego przeciwciała do komórek.
Zacznij od aspiracji pożywkę z każdej studzienki następnie utrwalenia
Komórki z 4% formaldehydu i 10% formaliny
przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Aspirację utrwalacz każdej studzienki i przepłukać dwukrotnie lodowatym PBS.
Należy uważać, aby nie pozwolić komórki wyschnąć w tym
lub dalszy etap protokołu.
Jeśli epitop swojego interesującego białka wyraża wewnątrzkomórkowo,
komórkowej przepuszczalności jest konieczne, aby uzyskać dostęp przeciwciał do
komórek.
Chociaż istnieje wiele różnych czynników przepuszczalności, najczęściej
to 0,1 - 0,5% stężenie Tween-20 lub
Triton X100
rozcieńczono w PBS.
Tween-20 stosuje się do znajdujących się w cytoplazmie epitopów
Triton X100 gdy stosuje permeabilizing jądro i mitochondria.
Inkubacji studzienki buforze przepuszczalności do 10 minut w temperaturze pokojowej.
Aspirację bufor przepuszczalności i przemyć trzy razy na 5 minut
każdy z PBS sznurka.
PBS szpagat zawiera 0,1% Tween-20.
Będziemy teraz zablokować niespecyficznych miejsc wiązania z buforem blokującym przez 1 godzinę
w temperaturze pokojowej.
Najlepsze buforu blokującego jest PBST zawierającym 10% surowicy z
gospodarzem gatunków swojego drugiego przeciwciała.
Jednakże, 1% BSA w PBST mogą być również stosowane.
Przygotowanie przeciwciał pierwotnych przez rozcieńczenie w buforze blokującym w zalecanej
rozcieńczenie podane na arkuszu danych.
Wiele zaostrzenie rozcieńczenia są korzystne w celu uwzględnienia zmiennych
mogą być różne w oznaczeniu i
do osiągnięcia jak najlepszych wyników.
Inkubacji w temperaturze 4 ° C w ciągu nocy.
W naszym przykładzie, ponieważ używasz nieskoniugowanego Podstawowej będziemy stosując fluorofor
sprzężony wtórne na dzień dwa.