Tip:
Highlight text to annotate it
X
Po electrotransfer naszych białek na membranę, zostanie teraz zablokować
osuszyć,
zastosowanie specyficznego przeciwciała podstawowego białka naszego zainteresowania i następnie przeciwciało wtórne
które rozpoznaje pierwszego przeciwciała.
Jest usunięcie błony z kasety i płukania trzykrotnie
woda.
W opcjonalnym kroku, można sprawdzić, białka przenoszono powodzeniem
przez barwienie błony z Ponceau czerwono.
Inkubować membranę w Ponceau pięć minut i zmyć wodą, aż
zespoły są jasne.
Po weryfikacji blot może być następnie de-barwiony, nadal zmyć
woda lub TBS sznurka do całkowitego usunięcia barwnika.
Musimy zablokować wszystkie obszary blot, które jeszcze nie zawierają białko.
Pozwoli to uniknąć niespecyficznego wiązania przeciwciał i zmniejszenia ogólnego
tło sygnał.
Wspólne bufory blokujące zawierające 5% odtłuszczone mleko w proszku w teście
w roztworze TBS sznurka.
Jednak nie używać mleka podczas wykrywania specyficznych przeciwciał z fosfo jak może
powodować wysokie tło z endogenny fosfoproteiny, cez.
Inkubować membranę roztworem blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej
w lekkim mieszaniu.
Zlać roztwór blokujący i przemyć TBS sznurka na pięć minut.
Teraz jesteśmy gotowi, aby dodać naszą przeciwciała. Rozcieńczyć przeciwciał pierwotnych, w
buforze blokującym w stężeniu zalecanym na arkuszu danych.
Inkubować przez noc w temperaturze 4 ° C z łagodnym wytrząsaniem.
Zalecana opcja krokiem jest również użyć dodatnią kontrolę załadowanej przeciwciała
które umożliwia sprawdzenie równe ilości białka całkowitego wprowadzono do każdego
dobrze i doradcy w rozwiązywaniu problemów poprzez usunięcie wszelkich niejasności
przy procedurze Western Blot. Następnego dnia, zlać się przeciwciała pierwotnego i
przemyć membranę dużych ilości TBS szpagatów i energiczne mieszanie
pięć razy w ciągu pięciu minut każda.
Te surowe przemywania są bardzo ważne dla usuwania niespecyficzne
sygnałów tła.
Po przemyciu, rozcieńczenie drugiego przeciwciała w roztworze blokującym i
membranę inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, w stężeniu
zalecane na arkuszu danych.
W tym przykładzie jest również wtórne HRP sprzężone na później
wykrywania.
Zlać membrany i umyć wtórne dużą ilością sznurka z TBS
pięciokrotnie energicznego mieszania przez pięć minut każdy. Jesteś teraz gotowy do
detekcji fazy.