Tip:
Highlight text to annotate it
X
Witamy w Novus serii Wizualnej Protocol.
W tym filmie dowiemy się, jak wykonać wszystkie etapy Western Blot przy użyciu
Najpopularniejsze metody w tym teście.
Zanim będzie można rozpocząć przygotowania blot najpierw musimy przygotować nasz lizatu próbki.
W tym przykładzie przygotowania białka z lizatu komórek hodowlanych.
Tutaj przepłukać komórki dwukrotnie PBS lodem buforu do lizy i wystarczająco
pokrycia komórki.
Wybór zależy głównie od buforu do lizy, na lokalizacji
swojego białka.
Mamy zeskrobać komórek i przenieść roztwór komórek w probówce
umieszczono w lodzie.
W celu rozpuszczenia białka związane z błoną, żądamy silniejsze
detergenty wydobycia w stosunku do izolowanych białek cytoplazmatycznych.
W tym przykładzie używamy standardowego buforu Ripa, który jest wspólny bufor
dla uzyskania maksymalnej wydajności białka. Podczas ekstrakcji białka z każdego
komórkowych lokalizacje,
Bardzo ważne jest to, aby jak inhibitorów proteazy w buforze lizy, który będzie
zapobiegania degradacji próbki. Zawsze należy używać świeżo przygotowane proteazę
Inhibitory przechowywać próbki na lodzie i działać szybko.
We wszy komórek przez pipetowanie w górę iw dół
następnie inkubowano na lodzie w ciągu pół godziny.
Następnie komórki wiruje się w granulki.
Wyrzucić osad i zebrać supernatant. To jest Twój lizat.
Określenia całkowitego stężenia białka Twojej lizatu próbki przez
testowanie niewielką część lizatu z dostępnego w handlu białka
Badanie ilościowe takie jak BCA.
To pomoże w załadunku równe ilości białka do swojego żelu.
Western blot są tradycyjnie wstępnie kształtowane pod zmniejszonym i skażone
warunki.
Warunki te pozwolą białka jest oddzielne ich masy cząsteczkowej
niż ojczysty konformacyjne kształt lub opłat.
Redukcji i denaturacji próbki
każdego rozcieńczenia w buforze do ładowania takiego jak tradycyjny bufora Laemmli.
Bufor ten zawiera beta-merkaptoetanol, DTT, zmniejszenie dwusiarczek
grzbiety między cystein,
SDS pomóc denaturacji zapewnić ujemny białko,
glicerol aby próbki popadają w każdej studzienki
błękit bromofenolowy wizualizować lizatu
i ikoniczny bufor.
Votex każda próbka i inkubować w temp. 95 stopni Celsjusza, na pięć minut do
całkowicie denaturacji białka. Teraz jesteśmy gotowi, aby załadować swoje próbki do
SDS strona żel.