Tip:
Highlight text to annotate it
X
Witamy w Novus serii Wizualnej Protocol.
W tym filmie dowiesz się jak wykonać wszystkie etapy fluorescencyjna
immunocytochemia
przy najbardziej typowych metod w tym teście.
Przed rozpoczęciem procedury ICC, pokażemy, jak przygotować
nakrywkowe i płyty hodowli komórek następuje poszycia naszych komórek.
Zaczynamy od kwasem nowych nakrywkowe w jeden molowy chlorowodorku kwasu do
24 godziny.
Po dokładnym przelewanie się kwas i usunięcie szkiełkach nakrywkowych,
myjemy każdy z wody destylowanej,
a następnie z etanolu końcowego płukania.
W ewentualnym etapie można umieścić szkiełka nakrywkowe w szafie robimy napisy
zanurzać
0,1 mg / roztwór żelatyny lub polilizyna
przez pięć minut.
Są aide powłoki dostarczyły dodatkowe przyleganie komórek do
nakrywkowe
zapewnić, że nie są oddzielone w późniejszych etapach przemywania.
Po zabiegu usunięcia statyw robimy napisy i osusz nakrywkowe w kulturze
kaptur lub piec.
Czystej suchej nakrywkowe następnie do każdej studzienki dodaje się z sześciu oraz
Płyta kultura
i pokryta pokrywą.
Aby zaoszczędzić czas, duże ilości płyt można przygotować z wyprzedzeniem, w celu późniejszego wykorzystania.
Płyty mogą być sterylizowane poprzez umieszczenie ich pod maską w świetle UV.
Czystych nakrywkowych przygotowanych sześć dołkowych płytkach,
teraz możemy dodać nasze komórki.
Platerowane tu w komórkach dodać gęstość jeden pół miliona komórek na studzienkę.
Komórki są następnie hodowane przez noc w inkubatorze, aż znajdą się w korzystnym
gęstości.
Z komórkami Plated dnia poprzedniego i nocleg hodowli, jesteśmy gotowi
rozpocząć z procedurą ICC.
W tym pierwszym dniu ICC, będziemy ustalać,
przepuszczalności,
blot i dodać pierwszego przeciwciała do komórek.
Zacznij od aspiracji pożywkę z każdej studzienki następnie utrwalenia
Komórki z 4% formaldehydu i 10% formaliny
przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Aspirację utrwalacz każdej studzienki i przepłukać dwukrotnie lodowatym PBS.
Należy uważać, aby nie pozwolić komórki wyschnąć w tym
lub dalszy etap protokołu.
Jeśli epitop swojego interesującego białka wyraża wewnątrzkomórkowo,
komórkowej przepuszczalności jest konieczne, aby uzyskać dostęp przeciwciał do
komórek.
Chociaż istnieje wiele różnych
czynniki przepuszczalności, najczęściej są 0,1 - 0,5%
stężenie
Tween-20
lub Triton-X100
rozcieńczono w PBS.
Tween-20 stosuje się do znajdujących się w cytoplazmie epitopów
Triton X100 gdy stosuje permeabilizing jądro i mitochondria.
Inkubacji studzienki buforze przepuszczalności do 10 minut w temperaturze pokojowej.
Aspirację bufor przepuszczalności i przemyć trzy razy w ciągu 5 minut z każdej
PBS sznurka.
PBS szpagat zawiera 0,1% Tween-20.
Będziemy teraz zablokować niespecyficznych miejsc wiązania z buforem blokującym przez 1 godzinę
w temperaturze pokojowej.
Najlepsze buforu blokującego jest PBST zawierającym 10% surowicę z gospodarza
gatunków swojego drugiego przeciwciała.
Jednak
1% BSA w PBST mogą być również stosowane.
Przygotowanie przeciwciał pierwotnych przez rozcieńczenie w buforze blokującym
w zalecanym rozcieńczeniu określonym arkuszu danych.
Wiele ostrzejszych rozcieńczenia korzystne uwagę, które mogą być zmienne
inny w teście
i osiągnięcia jak najlepszych wyników.
Inkubacji w temperaturze 4 ° C w ciągu nocy.
W naszym przykładzie,
skoro używasz nieskoniugowanego Podstawowej będziemy stosując fluorofor
sprzężony wtórne na dzień dwa.
W drugim dniu naszego postępowania ICC
dodamy naszą wtórnego przeciwciała,
wykonać opcjonalnego podwójnego znakowania i etykietowania, krok jądrowej
zamontować nasze nakrywkowe do slajdów
i uzyskania obrazów naszych przeciwciał z mikroskopu fluorescencyjnego.
Najpierw roztwór podstawowy aspirację się przeciwciał po przemywając komórki
trzykrotnie PBST pięć minut każdy.
Następna przygotować floraform sprzężonego wtórne przeciwciało, które wiążą się głównym
przeciwciała.
Rozcieńczyć wtórnego bufor blokujący
z rozcieńczenia zalecane określonym w arkuszu danych
i inkubowano w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.
Pokrycie płyt folią zabezpiecza wrażliwe barwników z poniżające.
Aspirację się wtórny roztwór przeciwciał następnie przemywanie komórek
trzykrotnie PBST
pięć minut każdy.
W opcjonalnym kroku drugie pary pierwotnej i wtórnej może być
wizualizować drugi epitop
za pomocą innego podłogi dla niego.
Ponadto, DNA, takie jak barwniki wiążące DAPI
może być stosowane bez konieczności wtórnych przeciwciał.
Odwoływanie się do pełnego pisemnego protokołu Novus dalsze instrukcje na temat dwu-i
potrójne etykieta.
Nakrywkowe są już gotowe do montażu na szkiełkach mikroskopowych.
Weź czysty slajd i zrezygnowanie kroplę antifade osadzania powoli
wybieranie dół tłok pipety.
Ostrożnie usunąć nakrywkowe ze studni,
pozwól, pranie na kapie
i umieścić komórki zakryte na slajdzie.
Jasne polski paznokci może być stosowane do uszczelniania i do nakrywkowe uniemożliwić
wysychaniem.
Szkiełka mogą być widoczne pod mikroskopem
i przechowywano w temperaturze -20 ° C lub 4
w ciemnym polu slajdów lub książki slajdów.
Ograniczenie czasu każdy slajd jest narażona na światło mikroskopu będzie doradca w
przedłużenie sygnał fluorescencyjny
i uniemożliwi zdjęcie wybielania.